"МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛИСТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ И ЛЮДЕЙ" (УТВ. ГОСАГРОПРОМОМ СССР 13.02.1987, МИНЗДРАВОМ СССР 04.09.1986)

архив

-Назад-

¦1.      ¦ 0,2 (1:1000) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
¦2.      ¦ 0,2 (1:1200) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦Полный   ¦
¦3.      ¦ 0,2 (1:1500) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦гемолиз  ¦
¦4.      ¦ 0,2 (1:1800) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
¦5.      ¦ 0,2 (1:2000) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
+--------+--------------+----------+----------+--------+---------+
¦6.      ¦ 0,2 (1:2500) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦Частичный¦
¦7.      ¦ 0,2 (1:3000) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦гемолиз  ¦
¦8.      ¦ 0,2 (1:3500) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
¦9.      ¦ 0,2 (1:4000) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
¦10.     ¦ 0,2 (1:5000) ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,4}  ¦         ¦
+--------+--------------+----------+----------+--------+---------+
¦Конт-   ¦ 0,2 (1:100)  ¦   0,2    ¦    -     ¦  0,6}  ¦Полная   ¦
¦рольные ¦      -       ¦   0,2    ¦   0,2    ¦  0,6}  ¦задержка ¦
¦        ¦      -       ¦   0,2    ¦    -     ¦  0,8}  ¦гемолиза ¦
L--------+--------------+----------+----------+--------+----------


Примечание: В данном примере предельный титр гемолитической сыворотки равен 1:2000, а для реакции следует применять ее в титре 1:500.



Титрование комплемента в гемолитической системе.

Комплемент титруют в дозах 0,02, 0,04, 0,06 и т.д. (с интервалом по 0,02 мл) до 0,20 мл основного его разведения. В каждую пробирку к недостающему до 0,2 мл количеству основного разведения комплемента добавляют физиологический раствор: в первую пробирку 0,18 мл, во вторую 0,16 мл и т.д. После этого во все пробирки наливают по 0,4 мл физиологического раствора и по 0,4 мл гемолитической системы. Реакция должна сопровождаться контролями компонентов в смеси с эритроцитами (контроль гемолизина, контроль комплемента, контроль физраствора), а также контролем гемолитической системы при максимальной дозе комплемента (0,2 мл основного разведения). После тщательного смешивания компонентов путем встряхивания, штативы с пробирками помещают на 10 минут в водяную баню при 37-38 град. C.

Титром комплемента в гемолитической системе считается наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в указанных условиях 0,2 мл взвеси эритроцитов при рабочей дозе гемолизина (таблица 3).

Если титр комплемента в гемолитической системе определяется дозой 0,18 мл и выше (основное разведение 1:20), то титрование в гемолитической системе повторяют, пользуясь основным разведением комплемента 1:10.



Таблица 3



Титрование комплемента в гемолитической системе



----+-------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----¬
¦1. ¦Комплемент в ¦0,02¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦
¦   ¦разведении   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦   ¦1:10 или 1:20¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+---+-------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦2. ¦Физраствор до¦0,18¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦0   ¦
¦   ¦объема 0,2 мл¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+---+-------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦3. ¦Сенсибилизи- ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦
¦   ¦рованные     ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦   ¦эритроциты   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦   ¦барана       ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦   ¦(гемолитичес-¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦   ¦кая система) ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+---+-------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦4. ¦Физраствор   ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦
+---+-------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦            Водяная баня при 37-38 град. C в течение 10 минут      ¦
¦                            Результат реакции                      ¦
+-----------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----T----+
¦                 ¦ ЗГ ¦ ЗГ ¦ ЧГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦
L-----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+-----


Примечание:

ЗГ - задержка гемолиза

ЧГ - частичная задержка гемолиза

ПГ - полный гемолиз



Титрование комплемента в бактериолитической системе.

В бактериолитической системе комплемент титруют, начиная с дозы на один - два интервала ниже против его титра в гемолитической системе. Если титр комплемента в гемолитической системе определяется дозой 0,08 мл основного разведения, то в бактериолитической системе его титруют в дозах: 0,04; 0,06; 0,08; 0,10 и т.д. до 0,20 мл того же основного разведения.

Каждую дозу комплемента исследуют с двумя листериозными и с двумя нормальными сыворотками в присутствии антигена (в рабочем титре) и с контролем сывороток без антигена.

Инактивированные в разведении 1:10 листериозные и нормальные сыворотки разливают по 0,2 мл в пробирки соответствующих рядов.

Таким образом, в бактериолитической системе комплемент титруют в 8-ми рядах пробирок (по 9 пробирок в каждом ряду).

Требуемые разведения комплемента целесообразно готовить сразу для всего опыта титрования; с этой целью берут дополнительный ряд пробирок, в который разливают применяемые при титровании дозы комплемента в десятикратном объеме, т.е. - 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 и т.д. до 2,0 мл. Недостающий до 2 мл объем жидкости в пробирках доливают соответствующим количеством физиологического раствора: 1,6; 1,4; 1,2; 1,0 и т.д. Приготовленные таким способом разведения комплемента разливают пипеткой или аппаратом Флоринского в соответствующие опытные пробирки по 0,2 мл: в первые пробирки всех 8-ми рядов из первого разведения (доза основного разведения 0,04 мл), во вторые пробирки всех 8-ми рядов из второго разведения (доза основного разведения 0,06 мл) и т.д. После разлива комплемента, в первые ряды пробирок с листериозными и нормальными сыворотками наливают по 0,2 мл антигена в рабочем титре, во вторые по 0,2 мл физиологического раствора. Компоненты смешивают энергичным встряхиванием штативов и помещают в водяную баню при 37-38 град. C на 20 минут (связывание комплемента). Затем во все пробирки наливают по 0,4 мл гемолитической системы, компоненты смешивают и штативы снова помещают в водяную баню при 37-38 град. на 20 минут (фаза гемолиза).

Титром комплемента в бактериолитической системе является минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз в пробирках с нормальными сыворотками с антигеном и без антигена, с листериозными сыворотками без антигена, при задержке гемолиза в пробирках с листериозной сывороткой и антигеном в течение 20 минут при 37-38 град. C (таблица 4), что принимается за рабочий титр комплемента для главного опыта.

8.2.3. Главный опыт

Разведение комплемента для главного опыта.

Количество чистого комплемента, необходимого для всего опыта, определяется по формуле:



                            A x B
                            ----- x 2,
                              C


Где: A - титр комплемента, установленный в баксистеме;

B - количество проб, подлежащих исследованию;

C - разведение комплемента.

Например, требуется произвести исследование 100 проб сывороток (с антигеном и без, т.е. 200 пробирок). Титр комплемента в бактериолитической системе 0,10 мл основного разведения 1:10.



                                            0,10 x 100 x 2
     Доза чистого комплемента равна 2,0 мл (--------------).
                                                  10


Количество разведенного комплемента для исследования 100 проб равно 40 мл (0,2 x 200), поэтому к 2,0 мл чистого комплемента следует добавить 38,0 мл физраствора.



Основные условия постановки главного опыта.

Реакцию ставят в общем объеме 1,0 мл всех компонентов, т.е. каждый компонент применяют в объеме 0,2 мл. Испытуемые сыворотки исследуют с антигеном и без антигена в разведении 1:10 после предварительной инактивации в водяной бане при температуре 56-60 град. C и выше, в зависимости от вида животных, в течение 30 минут. Комплемент применяют в установленном титре. Время связывания комплемента в бактериолитической системе 20 минут, реакция гемолиза - 20 минут (в водяной бане при 37-38 град. C).



Таблица 4



Титрование комплемента в бактериолитической системе



---+----------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----¬
¦1.¦Комплемент в    ¦0,04¦0,06¦0,08¦0,10¦0,12¦0,14¦0,16¦0,18¦0,20¦
¦  ¦основном        ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦разведении 1:10 ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+--+----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦2.¦Физраствор до   ¦0,16¦0,14¦0,12¦0,10¦0,08¦0,06¦0,04¦0,02¦0   ¦
¦  ¦объема 0,2 мл   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+--+----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦3.¦Антиген в       ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦  ¦рабочем титре   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦(первый ряд     ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦пробирок) или   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦физиологический ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦раствор (второй ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦ряд пробирок    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦без антигена)   ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+--+----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦4.¦Нормальная      ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦0,2 ¦
¦  ¦сыворотка в     ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
¦  ¦разведении 1:10 ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+--+----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦  ¦      Водяная баня при 37-38 град. С в течение 20 минут      ¦
+--+----------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----+
¦5.¦Гемолитическая  ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦0,4 ¦
¦  ¦система         ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦    ¦
+--+----------------+----+----+----+----+----+----+----+----+----+
¦        Водяная баня при 37-38 град. С в течение 20 минут       ¦
¦                       Результат реакции                        ¦
+-------------------+----T----+----T----+----T----+----T----+----+
¦                   ¦ ЧГ ¦ ЧГ ¦ ЧГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦ ПГ ¦
L-------------------+----+----+----+----+----+----+----+----+-----


Примечание: ЧГ - частичный гемолиз; ПГ - полный гемолиз.



Основные контроли главного опыта:

- отрицательная и положительная (листериозная) сыворотки в разведении 1:10 с антигеном и без антигена;

- антиген на антикомплементарность и гемотоксичность (двойная доза антигена с комплементом в рабочем титре и без комплемента), компоненты смешивают и ставят в водяную баню на 20 минут; после чего добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и снова выдерживают в водяной бане в течение 20 минут;

- гемолитическая система с комплементом и без комплемента;

- комплемент в двойной дозе с эритроцитами без гемолизина.

8.2.4. Учет и оценка результатов реакции.

Результаты реакции оценивают по степени задержки гемолиза эритроцитов в крестах 2 раза: первый раз - тотчас после водяной бани, второй раз - через 14-18 часов выдерживания проб при комнатной температуре по следующей схеме:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза эритроцитов, надосадочная жидкость прозрачная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

- (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.

Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста; сомнительной - при задержке гемолиза на 2 креста; отрицательной - при задержке гемолиза на 1 крест или полном гемолизе эритроцитов.

Животные, с сыворотками крови которых получены сомнительные реакции, подлежат повторному исследованию через 2-3 недели. При повторном получении сомнительной реакции результат исследования считают отрицательным.

8.3. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) при листериозе людей и животных

8.3.1. Общие положения.

8.3.1.1. РНГА с листериозным антигенным инактивированным эритроцитарным диагностикумом (ЭД) применяют при исследовании сывороток крови людей и животных для обнаружения листериозных антител с целью диагностики болезни.

8.3.1.2. РНГА рекомендуется для оперативных и диагностических серологических обследований с целью выявления закономерностей формирования противолистериозного иммунитета у различных групп людей и животных.

8.3.1.3. Определение возрастных, сезонных, профессиональных среднемноголетних колебаний уровня иммунитета является необходимым для всестороннего анализа напряженности эпизоотического и эпидемического процесса на конкретной географической территории.

8.3.1.4. РНГА используют для дифференциации противолистериозных 19S- и 7S - антител, что дает возможность отличить свежий инфекционный процесс от скрытого бактерионосительства и хронических малосимптомных форм заболевания.

8.3.1.5. РНГА также применяют для дифференциации поствакцинальных антител от постинфекционных.

8.3.1.6. РНГА - доступный, экономичный, легко воспроизводимый метод, позволяющий получать стандартные результаты и исследовать большое количество проб сывороток крови в весьма короткие сроки.

8.3.2. Компоненты реакции и условия их применения.

8.3.2.1. Солевые растворы и их приготовление:

- физиологический раствор (pH 7,0-7,2) для растворения сухой гипериммунной листериозной кроличьей сыворотки: 8,5 г хлорида натрия на 1 л дистиллированной воды;

- 0,15 М фосфатный буферный раствор (pH 7,2) для приготовления исходных разведений исследуемых сывороток, 0,2 М раствора солянокислого цистеина и постановки РНГА: раствор 1-21,19 г двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4x2H2O), предварительно высушенного в течение 3 суток при 37 град. C, растворяют в 1 л дистиллированной воды; раствор 2-20,41 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) растворяют в 1 л дистиллированной воды. Для получения 100 мл фосфатного буферного раствора (pH 7,2) 76,1 мл раствора 1 смешивают с 23,9 мл раствора 2;

- раствор мертиолата для консервирования исследуемых сывороток: препарат растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1:1000. Для консервирования сывороток используют приготовленный раствор мертиолата из расчета 1:10, т.е. конечная концентрация реактива должна составлять 1:10000.

8.3.2.2. Сухая гипериммунная листериозная кроличья сыворотка, используемая как положительный контроль, характеризующий чувствительность эритроцитарного диагностикума. Сыворотку раcтворяют физиологическим раствором до ее первоначального объема, указанного на этикетке ампулы.

8.3.2.3. 50%-ная взвесь формалинизированных бараньих эритроцитов для адсорбции исследуемых сывороток, содержащих антитела к эритроцитам барана.

8.3.2.4. Сухие контрольные формалинизированные эритроциты барана, представляющие 0,33%-ную взвесь после растворения в фосфатном буферном растворе (pH 7,2) в объеме, указанном на этикетке ампулы.

8.3.2.5. Сухой ЭД, представляющий формалинизированные эритроциты барана, сенсибилизированные инактивированным антигеном возбудителя листериоза. Антиген приготовлен из штамма листерий 9-127 первого серовара методом гидролиза предварительно высушенной в ацетоне бактериальной массы в фосфатном буферном растворе (pH 6,4).

Сухой ЭД и контрольные к нему эритроциты имеют вид пористой коричневой таблетки, которая при добавлении дистиллированной воды в течение 2 минут образует однородную взвесь коричневого цвета.

8.3.2.6. Для исследования используют свежие и консервированные сыворотки крови без признаков гнилостного распада и гемолиза.

8.3.2.7. Для дифференциации 19S - и 7S - антител, позволяющей отличить свежий инфекционный процесс от скрытого бактерионосительства и хронических малосимптомных форм заболевания, а также постинфекционное иммунное состояние от поствакцинального, используют 0,2 М раствор солянокислого цистеина. Его готовят перед использованием: 35,1 мг препарата растворяют в 1 мл 0,2 М раствора едкого натра.

8.3.2.8. Приготовление 0,2 М раствора едкого натра: 8 г реактива растворяют в 1 л фосфатного буферного раствора (pH 7,2).

8.3.3. Исследование сывороток крови людей и животных в РНГА.

8.3.3.1. Подготовка сывороток к исследованию.

Испытуемые сыворотки крови людей и животных разводят 1:5 в пробирках 0,15 М фосфатным буферным раствором (pH 7,2) для выявления наиболее специфичных 7S - антител, а для выявления антител суммарной активности (19S - + 7S - антитела) сыворотки крови кроликов разводят 1:10, сыворотки крови людей - 1:40, мелкого рогатого скота и свиней - 1:80, а крупного рогатого скота - 1:160. До постановки РНГА разведенные сыворотки, предназначенные для обнаружения антител суммарной активности, сохраняют при 4 град. C.

В пробирки с сыворотками, разведенными 1:5, вносят равный объем 0,2 М раствора солянокислого цистеина, получая исходное разведение 1:10. Эти пробирки закрывают резиновыми пробками и выдерживают при 37 град. C 2 часа. После этого, обработанные и необработанные раствором солянокислого цистеина, сыворотки исследуют в РНГА.

8.3.3.2. Подготовка к работе эритроцитарного диагностикума.

Для получения 0,33%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов сухой препарат растворяют 0,5 мл дистиллированной воды и к полученному объему добавляют 5,5 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). Эритроцитарный диагностикум выдерживают 20 минут, хорошо перемешивая, при комнатной температуре.

8.3.3.3. Постановка РНГА микрометодом.

Реакцию ставят в объеме 0,1 мл. В каждую лунку капельницей вносят по 0,05 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). В первую лунку ряда прибавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки в соответствующем разведении. С помощью микродилюторов по 0,05 мл сыворотки переносят из первой лунки во вторую, из второй в третью и т.д., т.е. готовят последовательные двукратные разведения. С целью выявления 7S - антител у людей и всех видов животных разведения в лунках должны соответствовать значениям 1:20 и 1:40. Для выявления антител суммарной активности пробы сывороток крови кроликов должны быть разведены в лунках с 1:20 до 1:80, людей - с 1:80 до 1:640, мелкого рогатого скота и свиней - с 1:160 до 1:640, а крупного рогатого скота - с 1:320 до 1:640. При получении положительных результатов определяется максимальный титр сывороток. После титрования и каждую лунку вносят по 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД. Панели оставляют при комнатной температуре и через 3-4 часа проводят предварительный учет результатов, а окончательный учет осуществляют на следующий день. Можно учитывать результат однократно после выдерживания панелей при 4 град. C в течение 16-18 часов.

8.3.3.4. Контроли, используемые в реакции:

- контроль ЭД и несенсибилизированных эритроцитов на отсутствие спонтанной агглютинации.

Для этого в одну лунку к 0,05 мл фосфатного буферного раствора (pH 7,2) добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД, а в другую лунку к тому же количеству буферного раствора - 0,05 мл контрольных 0,33%-ных несенсибилизированных эритроцитов;

- контроль специфичности РнГА для каждой исследуемой сыворотки.

Для этого к 0,05 мл исследуемой сыворотки в наибольшей для данного опыта концентрации добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси несенсибилизированных эритроцитов.

Во всех указанных случаях контроли должны быть отрицательными, т.е. агглютинации не должно быть. В случае положительного контроля исследуемой сыворотки, ее адсорбируют 50%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов барана согласно п. 8.3.3.5.;

- контроль чувствительности эритроцитарного диагностикума: титруют в объеме 0,05 мл гипериммунную листериозную кроличью сыворотку до титра, указанного на этикетке ампулы; в каждую лунку добавляют 0,05 мл 0,33%-ной взвеси ЭД. С учетом результатов серологических реакций в дальнейшем может быть использован ЭД, дающий реакцию с листериозной сывороткой не менее 1/3 ее предельного титра (положительный контроль).

8.3.3.5. В случае необходимости адсорбции исследуемых сывороток бараньими эритроцитами к 1 мл сыворотки добавляют 2 капли (0,1 мл) 50%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов. Смесь встряхивают и выдерживают 30 минут при 37 град. C или 60 минут при 20-22 град. C, либо 18 часов при 4 град. C. Сыворотку центрифугируют при 1,5 тыс. оборотов в мин. в течение 10 минут или отстаивают, после чего проводят ее повторное исследование в РНГА.

8.3.3.6. При использовании макрометода РНГА ставят в объеме 0,4 мл. В каждую лунку пипеткой вносят по 0,2 мл 0,15 М фосфатного буферного раствора (pH 7,2). В первую лунку ряда прибавляют 0,2 мл исследуемой сыворотки в соответствующем разведении. С помощью пипеток переносят по 0,2 мл сыворотки из первой лунки во вторую, из второй в третью и т.д., т.е. готовят последовательные двукратные разведения (п. 8.3.3.3.). После титрования в каждую лунку вносят по 0,2 мл 0,33%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума. Учет результатов проводят также как и при микрометоде (п. 8.3.4.).

8.3.4. Учет и оценка РНГА.

8.3.4.1. Учет результатов реакции проводят по четырехплюсовой системе:

++++ эритроциты покрывают все дно лунки ровным слоем, наблюдается картина "зонтика" с ровными краями;

+++ эритроциты покрывают дно лунки "зонтиком" несколько меньшего размера;

++ маленький "зонтик" с неровными краями и "пуговкой" в центре;

+ "пуговка" в центре лунки, имеются отдельные зерна агглютината; "пуговка" с ровными четко очерченными краями.

8.3.4.2. Реакция считается положительной, если наблюдается агглютинация на три и четыре плюса.

8.3.4.3. Оценку результатов РНГА проводят согласно титрам, указанным в таблице 5, с учетом антител суммарной активности и 7S - антител:



Таблица 5



---------------+---------------------------+---------------------¬
¦ Исследуемые  ¦ Положительные результаты  ¦    Сомнительные     ¦
¦  сыворотки   ¦                           ¦     результаты      ¦
¦              +---------------+-----------+-----------+---------+
¦              ¦ титр антител  ¦ титр 7S - ¦   титр    ¦титр 7S -¦
¦              ¦   суммарной   ¦  антител  ¦  антител  ¦ антител ¦
¦              ¦  активности   ¦           ¦ суммарной ¦         ¦
¦              ¦               ¦           ¦активности ¦         ¦
+--------------+---------------+-----------+-----------+---------+
¦Люди          ¦     1:640     ¦   1:40    ¦   1:320   ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:640     ¦   1:20    ¦   1:320   ¦    -    ¦
¦              ¦     1:640     ¦     -     ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:320     ¦   1:40    ¦   1:160   ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:160     ¦   1:40    ¦   1:80    ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:80      ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
¦              ¦       -       ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
+--------------+---------------+-----------+-----------+---------+
¦Крупный       ¦     1:640     ¦   1:40    ¦   1:320   ¦  1:40   ¦
¦рогатый       ¦     1:640     ¦   1:20    ¦   1:320   ¦  1:20   ¦
¦скот          ¦     1:640     ¦     -     ¦           ¦         ¦
+--------------+---------------+-----------+-----------+---------+
¦Мелкий        ¦     1:640     ¦   1:40    ¦   1:320   ¦  1:20   ¦
¦рогатый       ¦     1:640     ¦   1:20    ¦   1:320   ¦    -    ¦
¦скот          ¦     1:640     ¦     -     ¦   1:160   ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:320     ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:160     ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
+--------------+---------------+-----------+-----------+---------+
¦Свиньи        ¦     1:640     ¦   1:40    ¦   1:160   ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:640     ¦   1:20    ¦   1:160   ¦    -    ¦
¦              ¦     1:640     ¦     -     ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:320     ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:320     ¦   1:20    ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:320     ¦     -     ¦           ¦         ¦
¦              ¦     1:160     ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
+--------------+---------------+-----------+-----------+---------+
¦Кролики       ¦     1:80      ¦   1:40    ¦   1:40    ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:80      ¦   1:20    ¦   1:40    ¦    -    ¦
¦              ¦     1:80      ¦     -     ¦   1:20    ¦  1:20   ¦
¦              ¦     1:40      ¦   1:40    ¦           ¦         ¦
L--------------+---------------+-----------+-----------+----------


8.3.4.4. Во всех случаях более достоверные результаты могут быть получены при исследовании парных сывороток.

Для определения динамики нарастания антител суммарной активности первое исследование проводят на 8-9 день от начала болезни, а второе - на 16-18 день.

Для определения динамики нарастания 7S - антител первое исследование проводят также на 8-9 день от начала болезни, а второе - через 21-30 дней.

Нарастание титра антител суммарной активности в 4 и более раза, a 7S - антител - в 2 и более раза подтверждает диагноз листериоза.

8.3.4.5. Примерные значения титров антител суммарной активности и 7S - антител по срокам болезни указаны в таблице 6:



Таблица 6



-----------------------+-----------------------------------------¬
¦    Сроки болезни     ¦            Значения титров              ¦
¦                      +--------------------+--------------------+
¦                      ¦ антител суммарной  ¦    7S - антител    ¦
¦                      ¦     активности     ¦                    ¦
+----------------------+--------------------+--------------------+
¦ 8-9  день            ¦1:20-1:160          ¦  0                 ¦
¦16-18 день            ¦1:320 и более       ¦0-1:40              ¦
¦21-30 день            ¦1:160 и менее       ¦1:20 и более        ¦
L----------------------+--------------------+---------------------


8.3.4.6. Наиболее специфичные 7S - антитела сохраняются в сыворотке крови людей и животных более трех месяцев, что дает возможность проводить ретроспективный анализ исследуемого материала.



9. Л-ФОРМЫ ЛИСТЕРИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ



Листерии существуют как в классической бактериальной форме, так и в виде Л-форм.

Процесс Л-трансформации бактерий представляет собой широко распространенную биологическую закономерность. Возникают Л-формы под влиянием различных неблагоприятных воздействий и в дальнейшем проявляют высокую устойчивость к факторам, вызвавшим их появление. Частично или полностью утрачивая фрагменты клеточной стенки, Л-формы могут сохранять свою жизнеспособность в условиях, при которых невозможно существование классических бактериальных форм. В результате Л-трансформации в значительной степени изменяются биологические свойства микроорганизмов, что в свою очередь отражается на клиническом течении болезней, затрудняет их диагностику, а в ряде случаев может изменить характер эпидемического и эпизоотического процессов.

Листерии трансформируются в Л-форму под влиянием антибиотиков пенициллинового ряда, тетрациклина, факторов специфической и неспецифической резистентности организма (иммунной сыворотки, комплемента, глицина, лизоцима) и т.д. Трансформация происходит, когда перечисленные агенты не оказывают достаточного бактериостатического или бактерицидного эффекта. Л-формы, сохранившие фрагменты клеточной стенки, относятся к сферопластному типу. Л-формы, лишенные полностью клеточной стенки, принадлежат к протопластному типу.

При исключении фактора, вызывающего Л-трансформацию, Л-формы могут реверсировать в бактериальную культуру. Реверсирующие Л-формы называются нестабильными, а нереверсирующие - стабильными. Чаще реверсируют Л-формы листерий сферопластного типа.

9.1. Биологические свойства Л-форм листерий

9.1.1. Морфология.

Л-формы листерий имеют существенные морфологические различия с бактериальной формой возбудителя. Они состоят из разнообразных морфологических структур: шаровидных тел и тел неправильной конфигурации, вакуолизированных, гранулярных, зернистых форм и субмикроскопических (фильтрующихся) элементов. Все структуры связаны между собой цепью определенных взаимопревращений и способны к репродукции, размеры их варьируют от 5-8 до 0,15-0,2 мкм, что обуславливает возможность прохождения Л-форм через бактериальные фильтры. Л-формы листерий не отличаются по морфологии от Л-форм других бактерий, что исключает возможность использования этого теста в качестве дифференциального.

9.1.2. Культуральные свойства.

Л-формы листерий растут на полутвердых (1,3%), полужидких (0,3%) и жидких питательных средах. Для поддержания их жизнедеятельности и активной репродукции в среды добавляют 2-2,5% хлорида натрия и 2-5% нормальной лошадиной сыворотки без консерванта. При культивировании нестабильных Л-форм (в отличие от стабильных) в среды дополнительно вносят антибиотики или другие Л-трансформирующие агенты, дозы которых избирательно подбираются в каждом конкретном случае. Оптимальная температура выращивания Л-форм листерий 30 град. C, но они также хорошо растут при 20-37 град. C. На 1,3%-ном агаре Л-формы формируют типичные Л-колонии с оптически плотным гомогенным центром и ажурной периферией. В бульоне они растут в виде изолированных колоний или вызывают равномерное помутнение среды.

9.1.3. Биохимическая активность.

Несмотря на то, что морфология (данные светооптического исследования) и питательные потребности нестабильных и стабильных Л-форм листерий одинаковы, их биохимическая активность различна. Нестабильные Л-формы обычно ферментируют те же дифференциально-диагностические среды, что и бактериальные формы, но кислотообразование у них замедленное. Ферментативная активность стабильных Л-культур может в значительной степени снижаться, вплоть до полной ее утраты в отношении некоторых сахаров и спиртов. Сахаролитическая активность Л-форм листерий, подверженная значительным вариациям, не имеет решающего значения при их идентификации. Однако другие биохимические тесты, такие как каталазная активность и использование глюкозы по гексозомонофосфатному пути, постоянно присущи Л-формам листерий, независимо от степени их стабилизации, и могут быть использованы при идентификации любых форм возбудителя листериоза.

9.1.4. Антигенность и иммуногенность.

Антигенность и иммуногенность Л-форм листерий обусловлены наличием или отсутствием у них фрагментов клеточной стенки.

В антигенном отношении Л-формы сферопластного типа более близки бактериальным формам, чем Л-формы протопластного типа. Чем выше степень сохранности фрагментов клеточной стенки у Л-форм сферопластного типа, тем больше выражено их антигенное родство с бактериальными формами. В этих случаях они могут взаимодействовать с антибактериальной сывороткой в непрямом методе флюоресцирующих антител (НМФА) и в непрямом методе пероксидазных антител (НМПА), окрашиваясь на 3 и 4 креста.

Если степень сохранности фрагментов клеточной стенки у Л-форм сферопластного типа незначительна, то результаты НМФА и НМПА с антибактериальной сывороткой будут отрицательными или сомнительными.

Л-формы листерий протопластного типа не выявляются антибактериальной сывороткой в НМФА и НМПА. Несмотря на значительные изменения антигенных свойств листерий в процессе Л-трансформации, между бактериальными формами и их Л-формами сохраняется определенная общность антигенного строения (таблица 7), которая выявляется в реакциях агглютинации (РА), связывания комплемента (РСК) и диффузионной преципитации в геле (РДП).



Таблица 7



Антигенные связи клеточных компонентов бактериальной

формы листерий и их Л-форм сферопластного и

протопластного типов



----------------+---------------+--------------------------------¬
¦    Антиген    ¦   Иммунная    ¦            Реакции             ¦
¦               ¦   сыворотка   +------+------+-----T-----+------+
¦               ¦    против     ¦  РА  ¦ РДП  ¦ РСК ¦НМФА ¦ НМПА ¦
+---------------+---------------+------+------+-----+-----+------+
¦Бактериальная  ¦Бактериальной  ¦  +   ¦  +   ¦  +  ¦  +  ¦  +   ¦
¦форма          ¦формы          ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦Л-форм         ¦ +/-  ¦  +   ¦  +  ¦  -  ¦  -   ¦
¦               ¦протопластного ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦типа           ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦               ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦Л-формы        ¦Бактериальной  ¦  +   ¦  +   ¦  0  ¦ +/- ¦ +/-  ¦
¦сферопластного ¦формы          ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦типа           ¦Л-форм         ¦  +   ¦  +   ¦  0  ¦ +/- ¦ +/-  ¦
¦               ¦протопластного ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦типа           ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦               ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦Л-формы        ¦Бактериальной  ¦  +   ¦  +   ¦  0  ¦  -  ¦  -   ¦
¦протопластного ¦формы          ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦типа           ¦Л-форм         ¦  +   ¦  +   ¦  0  ¦  +  ¦  +   ¦
¦               ¦протопластного ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
¦               ¦типа           ¦      ¦      ¦     ¦     ¦      ¦
L---------------+---------------+------+------+-----+-----+-------


Обозначения:

+ результат положительный;

- результат отрицательный;

+/- результат сомнительный;

0 - реакцию не ставили, так как антиген Л-форм антикомплементарен.



Степень сохранности фрагментов клеточной стенки определяет иммуногенность Л-форм листерий. Л-формы протопластного типа обладают наименьшей иммуногенной активностью.

Гипериммунные сыворотки против Л-форм протопластного типа обычно взаимодействуют с гомологичными Л-антигенами в РА 1:80-1:160 и РДП 1:8-1:16, а с антигеном исходной бактериальной формы взаимодействуют в РА 1:10-1:40, РДП 1:2-1:8 и РСК 1:10.

9.1.5. Патогенность.

9.1.5.1. Вирулентные свойства

Нереверсирующие Л-формы сферопластного типа в условиях эксперимента вызывают в организме чувствительных животных изменения, характерные для инфицирования бактериальными культурами листерий. При гистологическом исследовании патологического материала при спонтанном листериозе от погибших людей (детей) и от животных, в органах которых бактериологическими методами были выявлены Л-формы листерий (НМФА они определены как Л-формы сферопластного типа), также обнаруживают изменения, типичные для листериозной инфекции. При нервной форме болезни они характеризуются развитием энцефалита с хорошо выраженным пролиферативным компонентом, наличием отека, дегенерации нейронов и нейронофагии. При септической форме болезни в печени, селезенке, надпочечниках, кишечнике образуются гранулемы, состоящие из клеток лимфоидного и гистиоцитарного типа.

Иным патогенетическим действием обладают Л-формы листерий протопластного типа, не дающие реверсии в условиях организма. Они не вызывают гибели куриных эмбрионов и конъюнктивальной реакции у морских свинок, однако при внутрикожном введении развивается некроз на месте инъекции. Мыши не являются чувствительной моделью для выявления вирулентных свойств стабильных Л-форм листерий протопластного типа. Они не проявляют клинически выраженных признаков заболевания при внутривенном, внутрибрюшинном, внутримозговом и подкожном методах заражения. Кортикостероиды не повышают чувствительность мышей к Л-формам листерий.

К экспериментальному инфицированию стабильными Л-формами листерий протопластного типа чувствительны ягнята. Продолжительность инкубационного периода может исчисляться от нескольких суток до 2-х месяцев. Картина болезни, время ее проявления, а также сроки гибели животных значительно варьируют в зависимости от индивидуальных особенностей организма. В одних случаях Л-формы листерий вызывают нервную форму листериоза, как правило, заканчивающуюся летальным исходом, в других случаях те же дозы возбудителя обуславливают развитие незначительных патологических изменений обратимого характера.

При нервной форме экспериментального листериоза, вызванной стабильными Л-формами листерий, у ягнят нарушается координация движений, появляется "вертячка", перед гибелью развиваются клонические и тонические судороги мышц шеи, туловища, конечностей. Температура тела, как правило, остается в пределах нормы.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что при экспериментальном инфицировании стабильными Л-формами листерий протопластного типа у ягнят в ряде случаев развивается классическая нейросимптоматика, характерная для спонтанного течения инфекции, которую обычно не удается моделировать при инфицировании овец бактериальными культурами.

9.1.5.2. Некоторые особенности патологических изменений, развивающихся в организме при инфицировании стабильными Л-формами протопластного типа.

Клиническая картина нервной формы листериоза является однотипной как для спонтанного листериоза, так и для экспериментального, воспроизводимого Л-формами листерий протопластного типа. Однако, в последнем случае патоморфологическая картина имеет свои особенности. При инфицировании Л-формами протопластного типа в головном и спинном мозге отсутствует пролиферативный компонент воспалительной реакции и на первый план выступают дистрофические и некротические поражения. Наиболее интенсивные изменения локализуются в коре больших полушарий, мозжечке, продолговатом мозге и хвостатом теле. Для поражений мозга характерны гиперемия сосудов и явления стаза, мелкие диапедезные кровоизлияния. Многие нервные клетки находятся в состоянии сильного отека, набухания, цитолиза и кариолизиса. В спинном мозге, кроме аналогичных дистрофических изменений со стороны нервных клеток, выявляют также изменения глиальных клеток. В сером веществе мозга обнаруживают кровоизлияния.

Таким образом, у ягнят развиваются изменения, которые можно отнести к энцефалопатии с распространенными дистрофическими поражениями центральной нервной системы, резким расстройством гемодинамики и почти полным отсутствием воспалительной клеточной реакции.

При летальном исходе дистрофические изменения обнаруживают также в печени, почках, надпочечниках, лимфоидной ткани. В селезенке и лимфатических узлах исчезают реактивые центры, происходит редукция фолликулов и вторичных узелков. У ягнят выявляют полную атрофию костного мозга. В синтиции ретикулярной стромы костного мозга остаются единичные клетки на фоне расширенных капилляров и мелких кровеносных сосудов.

При энцефалопатической форме листериоза, особенно если клиническая картина болезни возникла в отдаленные сроки после заражения, специфические антитела (агглютинины, комплементсвязывающие антитела, преципитины), как правило, отсутствуют. Они не выявляются ни антигеном Л-форм, ни бактериальным антигеном. Показатели лейкоформулы в это время резко изменены. Базофилы, эозинофилы и моноциты исчезают. Число лимфоцитов резко снижено, они дегенеративны. Элементы белой крови представлены, в основном, нейтрофилами, которые также претерпевают дегенеративные изменения. На рис. 1 изображен лейкоцитарный профиль, типичный для овец, больных нервной формой листериоза, в результате экспериментального инфицирования Л-формами листерий протопластного типа.



Рис. 1 Лейкоцитарный профиль овцы



Рисунок не приводится.



Таким образом, в процессе Л-трансформации изменяются морфологические, культуральные, биохимические, иммуногенные и вирулентные свойства листерий. Чем больше степень утраты возбудителем клеточной стенки, тем значительнее эти изменения. Трансформация листерий в Л-форму при спонтанном листериозе объясняет трудность обнаружения возбудителя обычными бактериологическими методами. При естественной листериозной инфекции Л-формы сферопластного типа вызывают в органах хозяина патологические изменения с хорошо выраженным пролиферативным компонентом, которые характерны для листериоза, обусловленного бактериальными формами. В тех случаях, когда возбудитель трансформируется в Л-формы протопластного типа, в организме имеют место дистрофические и некробиотические изменения при почти полном отсутствии пролиферативных явлений. Л-формы листерий протопластного типа являются индукторами энцефалопатической формы листериоза. В настоящее время энцефалопатии листериозной этиологии у людей и животных еще мало известны и почти не изучены.

Пониженная иммуногенная активность Л-форм листерий (особенно протопластного типа) и их способность вызывать атрофию лимфоидной ткани хозяина могут явиться причиной наличия низких титров специфических антител (или отсутствия их) при нервной форме листериоза человека и животных. В подобных случаях исследование сывороток крови в РА, РСК, РДП могут быть не эффективными, необходима бактериологическая диагностика.

9.2. Методы обнаружения Л-форм листерий

Методы обнаружения Л-форм листерий включают посевы патологического материала на питательные среды и идентификацию выделенных культур иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.

9.2.1. Микробиологическое исследование

Из органов и тканей делают посевы на среды, обычно используемые для выделения бактериальных форм листерий [мясопептонный или мясопептонный печеночный агар (МПА, МППА) или бульон (МПБ, МППБ) с добавлением 1% глюкозы и 2-3% глицерина, pH 7,2-7,4] и на полутвердые и жидкие Л-среды для культивирования Л-форм листерий в условиях лаборатории - 1,3%-ный МПА (МППА) и бульон, содержащие 2% хлорида натрия и 2% нормальной лошадиной сыворотки без консерванта.

При отрицательном результате первичного посева рекомендуется сохранять патологический материал в холодильнике при 4 град. C в течение 30 дней и проводить повторные исследования через каждые 10 дней.

Посевы инкубируют в течение 3-4 суток при 30 град. или 37 град. C. При отсутствии роста срок наблюдения увеличивают до 1-1,5 месяцев, но посевы при этом выдерживают при комнатной температуре (20-22 град. C).

Л-формы листерий при первичном посеве из организма могут вырастать не только на Л-среде, но и на обычных бактериальных средах, однако дальнейшие пересевы их, как правило, не удаются.

Выросшие на агаре Л-колонии листерий при визуальном просмотре похожи на бактериальные колонии этого возбудителя и в проходящем свете также имеют голубую окраску с зеленоватым оттенком. Однако при просмотре в микроскопе (объектив X10) колонии Л-форм имеют не мелкозернистую, характерную для бактериальных колоний, а кружевную структуру. Нередко Л-формы листерий формируют классические Л-колонии, для которых типичен уплотненный, врастающий в агар центр и более светлая ажурная периферия. Величина колоний варьирует от 0,1 до 1-2 мм в диаметре. В жидкой среде Л-формы также могут расти в виде изолированных колоний.

Л-формы листерий обладают каталазной активностью. Выделенные культуры изучают в фазово-контрастном микроскопе, окрашивают по Граму и исследуют иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.

Для окраски по Граму культуру Л-форм наносят на хорошо обезжиренные предметные стекла, подсушивают на воздухе и фиксируют на пламени. Окрашивать по Граму можно изолированные колонии агаровой культуры Л-форм, либо бульонную культуру, если в жидкую среду пересевали колонии с агара. Нельзя окрашивать по Граму бульонную культуру (если в среду засевали суспензию органов) и мазки-отпечатки органов, так как при этом возможны артефакты.

При окраске по Граму большинство структур Л-форм листерий грамположительны, но могут встречаться и единичные грамотрицательные структуры. Иногда при посеве в бульон изолированных бактериальных колоний листерий происходит спонтанная трансформация их в Л-форму и при окраске по Граму в мазке выявляются различной величины нередко вакуолизированные шаровидные структуры.

По чувствительности выявления Л-формы листерий в мазках-отпечатках органов и мазки культур Л-форм иммунофлюоресцентный и иммунопероксидазный методы практически равноценны. Различия их состоят в том, что в одном случае в качестве маркера антител применяют изотиоционат флюоресценна (ФИТЦ), а в другом случае - фермент пероксидазу, который выявляют с помощью 3,3-диаминобензидина тетрахлорида, при этом комплекс антиген-антитело окрашивается в темно-коричневый цвет.

Преимуществами иммунопероксидазного метода является слабое фоновое окрашивание препаратов, возможность их исследования в световом микроскопе и возможность хранения в течение длительного времени, а также возможность одновременного исследования препаратов морфологическими и иммунологическими методами.

Для выявления Л-форм листерий сферопластного типа с хорошо выраженной клеточной стенкой можно использовать сыворотку против бактериальных форм листерий, поэтому постановка реакции осуществляется в условиях любой бактериологической лаборатории. Л-формы листерий протопластного типа не выявляются антибактериальной сывороткой. Для работников научно-исследовательских учреждений в приложении 10.4. и 10.5. изложены схема получения гипериммунных сывороток против стабильных Л-форм листерий протопластного типа и метод выделения из них глобулиновой фракции, используемой в работе.

9.2.2. Окраска по непрямому методу флюоресцирующих антител (НМФА)

Для постановки реакции необходимы:

- поливалентная антибактериальная (против листерий 1-ой и 2-ой серогрупп) сыворотка кролика (для выявления бактериальных форм и Л-форм сферопластного типа) и глобулиновая фракция гипериммунной сыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа (для выявления Л-форм протопластного типа);

- антитела диагностические против Jg кролика, меченные ФИТЦ;

- химически чистый ацетон;

- забуференный физиологический раствор pH 7,2-7,4;

- глицерин на забуференном физрастворе pH 7,2-7,4 (1 часть глицерина нейтрального и 9 частей забуференного физраствора);

- дистиллированная вода;

- нефлюоресцирующее иммерсионное масло или химически чистый диметилфталат;

- тонкие, обезжиренные предметные стекла.

Мазки-отпечатки из органов высушивают на воздухе и фиксируют в течение 30 минут в химически чистом ацетоне. Мазки из культуры Л-форм фиксируют на пламени. После фиксации мазки делят на две группы - на 1 этапе на одни мазки наносят поливалентную антибактериальную сыворотку кролика (в рабочем разведении), на другие наносят немеченый глобулин сыворотки кролика против Л-форм протопластного типа листерий в разведении 1:4 (глобулины разводят забуференным физраствором pH 7,2-7,4);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 1 часа;

- препараты трижды промывают в забуференном физиологическом растворе (каждое промывание по 10 минут), ополаскивают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе;

- наносят антикроличью сыворотку, меченую ФИТЦ, в рабочем (не ниже 1:16) разведении (II этап);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 30 минут;

- препараты в течение 30 минут трижды промывают в забуференном физрастворе, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе;

- на окрашенные препараты наносят глицерин на забуференном физрастворе, накрывают покровным стеклом, на которое наносят нефлюоресцирующее иммерсионное масло и исследуют в люминесцентном микроскопе.

При исследовании материала необходимо ставить контроли, указанные в таблице 8.



Таблица 8



Контроли, необходимые при постановке НМФА и НМПА



----+---------------+-----------------+--------------+-----------¬
¦NN ¦    Антиген    ¦     Реагент     ¦   Реагент    ¦ Результат ¦
¦п/п¦               ¦   1-го этапа    ¦  2-го этапа  ¦           ¦
+---+---------------+-----------------+--------------+-----------+
¦1. ¦Гомологичный:  ¦Гомологичные     ¦              ¦           ¦
¦   ¦               ¦антитела         ¦              ¦           ¦
¦   ¦а) бактериаль- ¦поливалентная    ¦меченые       ¦           ¦
¦   ¦ная форма      ¦антибактериальная¦антитела      ¦           ¦
¦   ¦               ¦сыворотка кролика¦против        ¦положитель-¦
¦   ¦               ¦                 ¦глобулинов    ¦ный        ¦
¦   ¦               ¦                 ¦кролика       ¦           ¦
¦   ¦б) Л-формы     ¦глобулин         ¦      "       ¦    "      ¦
¦   ¦протопластного ¦сыворотки кролика¦              ¦           ¦
¦   ¦типа           ¦против Л-форм    ¦              ¦           ¦
¦   ¦               ¦протопластного   ¦              ¦           ¦
¦   ¦               ¦типа             ¦              ¦           ¦
¦2. ¦Гомологичный   ¦Забуференный     ¦Меченые       ¦Отрицатель-¦
¦   ¦               ¦физиологический  ¦антитела      ¦ный        ¦
¦   ¦               ¦раствор          ¦против        ¦           ¦
¦   ¦               ¦                 ¦глобулинов    ¦           ¦
¦   ¦               ¦                 ¦кролика       ¦           ¦
¦3. ¦Гомологичный   ¦Гомологичные     ¦Забуференный  ¦     "     ¦
¦   ¦               ¦антитела         ¦физиологичес- ¦           ¦
¦   ¦               ¦                 ¦кий раствор   ¦           ¦
¦4. ¦Гомологичный   ¦Нормальные       ¦Меченые       ¦     "     ¦
¦   ¦               ¦антитела         ¦антитела      ¦           ¦
¦   ¦               ¦(глобулины)      ¦против        ¦           ¦



-Главная-


Навигация

Разное

Новости от партнеров

Рейтинг

Rambler's Top100
Рейтинг@Mail.ru
 

 

Архив документов

2009 2008 2007 2006 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 1990 1928-1989