"МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЛИСТЕРИОЗА ЖИВОТНЫХ И ЛЮДЕЙ" (УТВ. ГОСАГРОПРОМОМ СССР 13.02.1987, МИНЗДРАВОМ СССР 04.09.1986)

архив

-Назад-

¦   ¦               ¦кролика          ¦глобулинов    ¦           ¦
¦   ¦               ¦                 ¦кролика       ¦           ¦
¦5. ¦Гетерологичный:¦                 ¦              ¦           ¦
¦   ¦а) возбудитель ¦поливалентная    ¦      "       ¦     "     ¦
¦   ¦рожи свиней    ¦листериозная     ¦              ¦           ¦
¦   ¦(бактериальная ¦антибактериальная¦              ¦           ¦
¦   ¦форма)         ¦сыворотка кролика¦              ¦           ¦
¦   ¦б) стабильные  ¦глобулин         ¦      "       ¦     "     ¦
¦   ¦Л-формы        ¦сыворотки кролика¦              ¦           ¦
¦   ¦стрептококка   ¦против Л-форм    ¦              ¦           ¦
¦   ¦или            ¦листерий         ¦              ¦           ¦
¦   ¦стафилококка   ¦протопластного   ¦              ¦           ¦
¦   ¦               ¦типа             ¦              ¦           ¦
L---+---------------+-----------------+--------------+------------


Препараты-отпечатки органов для уменьшения неспецифического свечения ткани следует окрашивать методом контрастирования. С этой целью на мазки наносят смесь люминесцирующей сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином, в соответствии с Временным наставлением по его применению. Меченый альбумин окрашивает ткани в оранжево-красный цвет.

Целесообразно сочетать просмотр препаратов одного и того же поля зрения одновременно в люминесцентном микроскопе (освещение сверху) и в фазово-контрастном устройстве (освещение снизу).

Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система:

++++ яркая, изумрудно-зеленая люминесценция бактерий или различных по морфологии и величине структур Л-форм, часто свечение по периферии более интенсивное;

+++ отчетливо выраженная, достаточно яркая зеленая люминесценция, периферический ободок хорошо выражен;

++ недостаточно яркая желтовато-зеленоватая люминесценция, периферический ободок еле заметен;

+ люминесценция слабая, желтая.

Положительным результатом считается люминесценция клеток на 4 и 3 креста при наличии в каждом поле зрения не менее 2-5 специфически светящихся бактерий или полиморфных структур Л-форм различной величины.

9.2.3. Окраска по непрямому методу пероксидазных антител (НМПА)

Для постановки реакции необходимы:

- поливалентная антибактериальная (против листерий 1-ой и 2-ой серогрупп) сыворотка кролика и глобулиновая фракция гипериммунной сыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа;

- антитела диагностические против Jg кролика, меченные пероксидазой;

- химически чистый ацетон;

- 0,5%-ный раствор перекиси водорода в метаноле;

- забуференный физиологический раствор pH 7,2-7;4;

- сыворотка крупного рогатого скота, разведенная физиологическим раствором 1:5;

- 0,05%-ный свежеприготовленный раствор 3,3 - диаминобензидина тетрагидрохлорида (ДАБ), содержащий 0,3% перекиси водорода. Приготовление раствора ДАБ: 5 мг 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлорида растворяют в 10 мл забуференного физиологического раствора и добавляют 0,3% перекиси водорода в конечном разведении.

Для иммунопероксидазного исследования патологического материала из паренхиматозных органов и головного мозга готовят мазки-отпечатки. После высушивания на воздухе их фиксируют в течение 30 минут в химически чистом ацетоне. Мазки культур Л-форм фиксируют на пламени. После фиксации для инактивирования эндогенной пероксидазы препараты обрабатывают свежеприготовленным 0,5%-ный раствором перекиси водорода в метаноле в течение 30 минут;

- промывают в забуференном физиологическом растворе в течение 15 минут;

- обрабатывают в течение 10 минут сывороткой крупного рогатого скота, разведенной 1:5 (блокируют неспецифическое фоновое окрашивание ткани), высушивают фильтровальной бумагой.

Мазки делят на две группы - на 1 этапе на одни мазки наносят поливалентную антибактериальную сыворотку кролика (в рабочем разведении), на другие - немеченый глобулин антисыворотки кролика против Л-форм листерий протопластного типа в разведении 1:4 (разводят глобулины забуференным физиологическим раствором pH 7,2-7,4);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 1 часа;

- препараты трижды промывают в забуференном физрастворе (каждое промывание по 10 минут), ополаскивают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе;

- наносят в рабочем разведении антисыворотку к Jg кролика, меченную пероксидазой (II этап);

- инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 30 минут;

- промывают забуференным физраствором и окрашивают в течение 10 минут 0,05%-ным свежеприготовленным, содержащим 0,3% перекиси водорода, раствором ДАБ;

- препараты в течение 30 минут промывают в проточной воде, заключают в бальзам и просматривают в световом микроскопе.

Контроли, необходимые при постановке реакции, указаны в таблице 8.

При положительном результате на желтоватом фоне бактериальные формы и структуры Л-форм окрашиваются в коричневый или темно-коричневый цвет.

9.3. Предварительный диагноз ставят на основании комплекса эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических и гистологических изменений, а также при наличии возбудителя в мазках-отпечатках органов.

9.4. Окончательный диагноз на листериоз устанавливают в случае выделения возбудителя (бактериальной формы, нестабильной или стабильной Л-формы). Стабильные Л-формы листерий, не давшие реверсии должны быть идентифицированы иммунофлюоресцентным или иммунопероксидазным методами.



10. ПРИЛОЖЕНИЯ



10.1. Схема лабораторного исследования на листериоз



Приложение 10.1



Схема 1





СХЕМА

ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ НА ЛИСТЕРИОЗ



                                      ----------------------¬
                          ------------+Пробы патологического+------------------------------------------------¬
                          ¦           ¦     материала       +--------------------------¬
                          ¦           L------------------+---                                                ¦
                          ¦                                                            ¦                     \/
                          ¦                              ¦                                            ----------------¬
                          ¦                                                            \/             ¦Гистологическое¦
                          \/                             \/                        ----------------¬  ¦исследование   ¦
------¬    ----------------------------------¬   -- - - - - - - - - - - - ¬        ¦ Серологическое¦  L------+---------
¦ РНФ ¦<---+  Обнаружение бактериальных форм ¦       Обнаружение Л-форм            ¦ исследование  ¦         \/
L--T---    ¦ листерий (основное исследование)¦   ¦листерий (дополнительное¦        L-T--------------  ----------------¬
   ¦       L-T-----------+-----------------T--          исследование)                ¦    -------¬    ¦  Микроскопия  ¦
   ¦         ¦           ¦                 ¦     L- - - - - - - - - - - - -          +--->¦  РА  ¦    L-T--------------
   ¦         ¦           ¦                 ¦             ¦               ¦           ¦    L-------      ¦
   ¦         \/          \/                \/            \/              \/          ¦                  ¦    -------------¬
   ¦  ------------¬ ---------------¬  -------------¬ -- - - - - - - -¬ -- - - - -¬   ¦    -------¬      ¦    ¦Окрашивание ¦
   ¦  ¦Мазки-отпе-¦ ¦Обильые и     ¦  ¦Заражение   ¦  Мазки-отпечатки  ¦Посев на     +--->¦ РНГА ¦      +--->¦гематоксили-¦
   ¦  ¦чатки внут-¦ ¦множественные ¦  ¦лабораторных¦ ¦внутренних     ¦   Л-среды ¦   ¦    L-------      ¦    ¦нэозином    ¦
   ¦  ¦ренних     ¦ ¦посевы на     ¦<-+животных    ¦  органов,         L T- T- - -   ¦    -------¬      ¦    L-------------
   ¦  ¦органов,   ¦ ¦простые,      ¦  ¦суспензией  ¦ ¦головного мозга¦               +--->¦ РСК  ¦      ¦
   ¦  ¦головного  ¦ ¦обогащенные   ¦  ¦органов     ¦ L- -T- - - - - --   ¦  ¦        ¦    L-------      ¦    -------------¬
   ¦  ¦мозга и    ¦ ¦или элективные¦  L-------------                                 ¦    -------¬      +--->¦  по Браше  ¦
   ¦  ¦крови      ¦ ¦питательные   ¦                     ¦               ¦  ¦        +--->¦ НМФА ¦      ¦    L-------------
   ¦  L----+------- ¦среды         ¦                                                 ¦    L-------      ¦
   ¦       \/       L-------+-------          -- - - - ---               ¦  ¦        ¦                  ¦    -------------¬
   ¦  ------------¬         ¦                                                        ¦    -------¬      L--->¦  по Нисслю ¦
   ¦  ¦Микроскопия¦         ¦                 ¦     -- - - - - ¬         ¦  ¦        L--->¦ НМПА ¦           L-------------
   ¦  L-T----------         ¦                  - -->    НМФА                              L-------
   ¦    ¦    ------------¬  ¦                 ¦     L - - - - --         ¦  ¦                               L-------V-------
   ¦    +--->¦Окрашивание¦  ¦                                                            L----V----                 ¦
   ¦    ¦    ¦по Граму   ¦  ¦                 ¦     - - - - - -          ¦  ¦                 ¦                     ¦
   ¦    ¦    L------------  ¦                 L- -->    НМПА   ¦                              ¦                     ¦
   ¦    ¦     -----------¬  ¦                       L - - - - --         ¦  ¦                 ¦                     ¦
   ¦    +---->¦   НМФА   ¦  ¦                                                                 ¦                     ¦
   ¦    ¦     L-----------  ¦                                            ¦  ¦                 ¦                     ¦
   ¦    ¦     -----------¬  ¦                         -- - - - - - - - - -                    ¦                     ¦
   ¦    L---->¦   НМПА   ¦  ¦                                               ¦                 ¦                     ¦
   ¦          L-----------  ¦                         ¦                                       ¦                     ¦
   ¦                        ¦                                               ¦                 ¦                     ¦
   ¦                        \/                        \/                    \/                ¦                     ¦
   ¦                 --------------¬           -- - - - - - -¬      -- - - - - - -¬           ¦                     ¦
   ¦                 ¦Бактериальная¦           ¦Культура     ¦       Культура                 ¦                     ¦
   ¦                 ¦  культура   ¦           ¦нестабильных ¦      ¦стабильных   ¦           ¦                     ¦
   ¦                 L------+-------           ¦Л-форм       ¦       Л-форм                   ¦                     ¦
   ¦                        ¦                  L- - - T - - --      L- - - - - - --           ¦                     ¦
   ¦            ------------+-------¬                 ¦                     ¦                 ¦                     ¦
   ¦            ¦                   ¦                 ¦                     ¦                 ¦                     ¦
   ¦            \/                  \/                \/                    \/                ¦                     ¦
   ¦    ------------¬        ------------¬     -- - - - - - -¬      -- - - - - - -¬           ¦                     ¦
   ¦    ¦ Смешанная ¦        ¦  Чистая   ¦      Бактериальная       ¦1. Микроско-             ¦                     ¦
   ¦    ¦ культура  ¦        ¦ культура  ¦     ¦культура     ¦          пия, окра-¦           ¦                     ¦
   ¦    L-----+------        L-------+----      (ревертант)         ¦   шивание               ¦                     ¦
   ¦          ¦                      ¦         L- - - T - - --          по Граму  ¦           ¦                     ¦
   ¦          \/                     \/                             ¦2. Проба на              ¦                     ¦
   ¦ --------------------¬   -------------------¬     ¦                 каталазу  ¦           ¦                     ¦
   ¦ ¦Получение чистой   ¦   ¦1. Окрашивание по ¦                   ¦3. НМФА                  ¦                     ¦
   ¦ ¦культуры путем     ¦   ¦   Граму, микро-  ¦     ¦              4. НМПА      ¦           ¦                     ¦
   ¦ ¦последовательных   ¦   ¦   скопия         ¦                   L- - - - - - --           ¦                     ¦
   ¦ ¦пересевов на       ¦   ¦2. Подвижность при¦     ¦                     ¦                 ¦                     ¦
   ¦ ¦питательных средах,+-->¦   22-25 град. C  ¦<- - -                                       ¦                     ¦
   ¦ ¦отбора колоний,    ¦   ¦3. Проба на ката- ¦                           ¦                 ¦                     ¦
   ¦ ¦пассажа через      ¦   ¦   лазу           ¦                                             ¦                     ¦
   ¦ ¦лабораторных       ¦   ¦4. Лизис листе-   ¦                           ¦                 ¦                     ¦
   ¦ ¦животных           ¦   ¦   риозным бакте- ¦                                             ¦                     ¦
   ¦ L--------------------   ¦   риофагом       ¦                           ¦                 ¦                     ¦
   ¦                         L-------------------                                             ¦                     ¦
   ¦                                                                        ¦                 ¦                     ¦
   ¦                                                                                          ¦                     ¦
   ¦                         -------------------¬                           ¦                 ¦                     ¦
   ¦                         ¦      Ответ       ¦<- - - - - - - - - - - - - -                 ¦                     ¦
   L------------------------>¦  дается в срок   ¦<---------------------------------------------                     ¦
                             ¦   до 14 дней     ¦<-------------------------------------------------------------------
                             L-------------------




10.2. Рецепты и способы приготовления индикаторных и элективных сред

10.2.1. Индикаторные среды

Для приготовления индикаторных сред необходимо иметь:

а - мясопептонный бульон или бульон Хоттингера pH 7,3-7,5;

б - индикаторы:

- настойка лакмуса - 5 г сухого лакмуса (но не лакмойда) растирают в порошок, смешивают с 50 мл спирта-ректификата и ставят в термостат при температуре 37 град. C на 3 дня; каждый день спирт меняют. На четвертые сутки спирт сливают, порошок высушивают в чашке Петри и заливают десятикратным количеством дистиллированной воды; раствор фильтруют;

- метиленовую синь, нейтраль-рот, метил-рот, конго-рот и амидо-черный готовят в виде 0,1%-ных растворов на дистиллированной воде и стерилизуют отдельно от питательной среды при 1 атм. 30 минут.

Приготовление индикаторных сред

10.2.1.1. Среда с лакмусом: к 100 мл МПБ или бульона Хоттингера добавляют 1 мл настойки лакмуса. Цвет среды сиреневый.

10.2.1.2. Среда с нейтраль-ротом в смеси с метиленовой синью: к 100 мл МПБ или бульона Хоттингера добавляют по 1 мл 0,1%-ных растворов нейтраль-рота и метиленовой сини. Цвет среды зеленовато-голубоватый или зеленый.

Среды с лакмусом и нейтраль-ротом в смеси с метиленовой синью разливают по пробиркам с ватными пробками и стерилизуют при 1 атм. 30 минут.

10.2.1.3. Среда с метил-ротом: в пробирку с 10 мл стерильного МПБ или бульона Хоттингера добавляют 0,3 мл стерильного 0,1%-ного водного раствора метил-рота, цвет среды лимонно-желтый.

10.2.1.4. Среда с конго-ротом: в пробирку с 10 мл стерильного МПБ или бульона Хоттингера добавляют 0,3 мл стерильного 0,1%-ного водного раствора конго-рота, цвет среды красный.

10.2.1.5. Среда с амидо-черным: к 10 мл стерильного МПБ или бульона Хоттингера добавляют 0,3 мл стерильного 0,1%-ного водного раствора амидо-черного, цвет среды черный с фиолетовым оттенком.

Примечание: Практически 0,1%-ные стерильные растворы метил-рота, конго-рота, амидо-черного можно добавлять в пробирки со стерильным МПБ или бульоном Хоттингера стерильной пастеровской пипеткой из расчета по 1 капле раствора индикатора на 1 мл бульона.



10.2.2. Элективные среды

10.2.2.1. Среда с теллуритом калия.

К 1 л расплавленного МПА (pH 7,2-7,4) перед разливом в бактериологические чашки добавляют 10 мл 2%-ного водно-глицеринового раствора теллурита калия (выпускается хим. фарм. заводом им. Семашко).

Добавление к указанной среде 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота улучшает рост листерий.

10.2.2.2. Среда с теллуритом калия и флоримицином или полимиксином.

К 1 л расплавленного МПА (pH 7,2-7,4) перед разливом добавляют 10 мл 2%-ного водно-глицеринового раствора телурита калия и 0,3-0,5 мл раствора флоримицина или полимиксина (500 тыс. ед. препарата разводят в 10 мл физиологического раствора).

Цвет колоний на среде с теллуритом калия черный, в связи с восстановлением теллурита калия до металлического теллура.



10.3. Определение комплементсвязывающих антител у китообразных при листериозе

10.3.1. Сероэпидемиологические исследования "одомашниваемых" китообразных и обслуживающего их персонала позволяют решать ряд важных вопросов, возникающих в процессе изучения инфекционных болезней, общих для человека и морских млекопитающих.

Изучение иммуноструктуры в отношении возбудителя листериоза в местах содержания китообразных является основным показателем, характеризующим интенсивность эпизоотического и эпидемического процесса. Кроме того, диагноз на эту болезнь можно опосредованно поставить по достоверной разнице титров гуморальных антител в парных сыворотках больных с характерной для листериоза клинической картиной.

Выявлена выраженная антикомплементарность сывороток морских млекопитающих (ластоногих и китообразных), которая полностью снимается дополнительной обработкой сыворотки CO2.

10.3.2. Методика обработки сыворотки

10.3.2.1. Техника взятия крови у китообразных.

Кровь у китообразных берут шприцом стерильно из хвостовой вены в количестве 5-10 мл. Участок кожи хвостового плавника обрабатывают в следующей последовательности:

а - 75%-ным раствором этилового спирта;

б - 3%-ным раствором перекиси водорода;

в - 96%-ным раствором этилового спирта.

Сыворотку крови получают по общепринятой методике, ампулируют и хранят в холодильнике при температуре +4 град. C.

10.3.2.2. Обработка сывороток углекислотой.

Полученную цельную сыворотку разводят 1:10 дистиллированной водой и из аппарата Кипа пропускают через нее CO2 в течение 5-7 мин. до интенсивного помутнения.

Вместо газообразной кислоты используют сухой лед, которым насыщают дистиллированную воду. Насыщенным раствором СО2, разводят цельную сыворотку 1:10 и оставляют при комнатной температуре до интенсивного помутнения. Обработанную таким методом сыворотку центрифугируют при 1500 об/мин. в течение 10 минут, надосадочную жидкость отсасывают и добавляют к ней 1/10 объема 8,5%-ного раствора NaCl. Непосредственно перед постановкой РСК сыворотку инактивируют прогреванием в водяной бане при 50 град. в течение 30 минут или при 60-65 град. в течение 20 минут.

10.4. Получение гипериммунных сывороток против стабильных Л-форм листерий протопластного типа

    10.4.1.  Для  получения антигена Л-формы листерий выращивают в
течение 6-7 суток (3 суток при температуре 37 град. C, 3-4 суток -
при  20-22 град. C) в жидкой среде, содержащей 2% хлорида натрия и
2%  нормальной  лошадиной  сыворотки без консерванта. Культуру 6-7
суточного  возраста осаждают центрифугированием в течение 40 минут
при   10000   об/мин.  Осадок  отмывают  от  среды  в  физрастворе
трехкратным   центрифугированием   при  этом  же  режиме.  Отмытую
культуру   Л-форм   разводят   физраствором   до   сметанообразной
                 9     10
консистенции  (10  - 10 колониеобразующих единиц в 1 мл),  убивают
прогреванием  при 56 град. C   в  течение   часа   и  консервируют
мертиолатом 1:10000 в конечном разведении.

10.4.2. Для получения гипериммунных сывороток кроликов иммунизируют по схеме Плесчиа, предусматривающей 3-кратное введение антигена с недельными интервалами. Вводят антиген в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Для гипериммунизации используют кроликов, давших до начала обработки отрицательные результаты в РА и РДП с бактериальным антигеном и антигеном Л-форм.

10.4.2.1. Схема гипериммунизации:

Первое введение: 1 мл антигена Л-форм смешивают с 1 мл подогретого неполного адъюванта Фрейнда. С помощью туберкулинового шприца по 0,02 мл смеси вводят внутрикожно в каждую подушечку 4-х коготков задней лапы кролика. Оставшиеся 1,9 мл вводят внутримышечно в бедро той же лапы.

Второе введение: через 7 дней смесь по той же методике и в той же дозе инъецируют в другую заднюю лапу.

Третье введение: через 14 дней 0,1 мл смеси вводят внутрикожно вдоль позвоночника кролика в пять точек по 0,02 мл в каждую из них. Остальные 1,9 мл инъецируют внутримышечно (в бедро) в ту же лапу, что и при первом введении.

10.4.3. Обескровливают животных через 10-12 суток после последней иммунизации при титре антител в РДП с антигеном Л-форм 1:4-1:8.

Из данных гипериммунных сывороток получают глобулины, которые используют при исследовании иммунопероксидазным и иммунофлюоресцентным методами.

10.5. Выделение глобулиновой фракции гипериммунной кроличьей сыворотки против стабильных Л-форм листерий протопластного типа

10.5.1. Для выделения глобулиновой фракции применяют полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярным весом - 6000. В работе, используют 20%-ный раствор ПЭГ на дистиллированной воде. Перед выделением глобулиновой фракции измеряют pH сыворотки. Сыворотка должна иметь pH 7,5. Регулирование pH до нужной величины проводят растворами соляной кислоты или щелочи.

10.5.2. К иммунной сыворотке (pH 7,5) прибавляют равный объем 20%-ного раствора ПЭГ. Смесь оставляют на 15 минут для формирования осадка. Затем смесь центрифугируют при 6000 об/мин. в течение 15 минут. Надосадок удаляют, а осадок растворяют до исходного объема сыворотки в 0,02 М Na-фосфатном буфере с 0,15 молями NaCl (pH 7,0) <*>. К осадку, растворенному в буфере, вновь добавляют равный объем 20%-го раствора ПЭГ и через 15 минут центрифугируют (растворение осадка в буфере, осаждение 20%-ным раствором ПЭГ и центрифугирование повторяют еще дважды, т.е. в общей сложности эту манипуляцию проводят трижды). После третьего центрифугирования осадок в четвертый раз растворяют буфером, объем которого в 3 раза меньше исходного объема сыворотки. Полученную фракцию глобулинов для освобождения от ПЭГ смешивают с хлороформом (на 9 частей глобулиновой фракции прибавляют 1 часть хлороформа). Смесь встряхивают в течение 30 минут. После чего ее центрифугируют при 10000 об/мин. в течение 20 минут. Хлороформ оседает на дно пробирки, а верхнюю фракцию глобулинов, свободную от ПЭГ, отсасывают и в дальнейшем используют в иммунофлюоресцентном и иммунопероксидазном исследованиях.

--------------------------------

<*> Приготовление 0,02 М Na-фосфатного буфера с 0,15 молями NaCl (рН 7,0):3,12 г NaH2PO x 2H2O (однозамещенный, м.в. - 156) растворить в 1 л дистиллированной воды. Затем в раствор добавить 8,5 г NaCl.



10.6. Методика выделения листерий из силоса

Силос плохого качества (pH свыше 5,5) является благоприятной средой для размножения листерий, особенно в его поверхностных слоях. При необходимости проводят бактериологическое исследование силоса.

Для исследования из разных участков берут 5-10 проб силоса массой около 100 граммов каждая. Из них отбирают среднюю пробу, из которой получают сок. Оставшуюся часть силоса хранят при +4 град. C. Определяют pH сока; при pH 5,4 и ниже исследование проводить нецелесообразно.

Затем по 0,2 мл сока засевают в 9 пробирок МПБ с 10% хлорида натрия. Посевы делят на 3 части (по 3 пробирки) и выращивают:

при +37 град. C - 48 часов;

при +22 град. C - 5 дней;

при +4 град. C - 10 дней.

После истечения срока выращивания из бульонов делают пересев на элективные среды в чашках, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Независимо от результатов микроскопии заражают 2-х белых мышей (масса 14-16 г) подкожно в дозе 0,2-0,3 мл.

В случае гибели зараженных животных из их органов делают мазки и посевы на питательные среды. Полученные культуры идентифицируют согласно п. 4.

При отрицательном результате повторные исследования проб силоса, хранившихся при +4 град. C, проводят через 10 дней в течение месяца.









-Главная-


Навигация

Разное

Новости от партнеров

Рейтинг

Rambler's Top100
Рейтинг@Mail.ru
 

 

Архив документов

2009 2008 2007 2006 2005 2004 2003 2002 2001 2000 1999 1998 1997 1996 1995 1994 1993 1992 1991 1990 1928-1989